Dane techniczne
Instrukcja użytkowania kolumn/płytek do odsalania c18
Wprowadzenie do produktu
Kolumny/płytki odsalające C18 są wypełnione matrycą żelu krzemionkowego C18, której grupa funkcyjna, oktadecylowa, ma wysoką hydrofobowość i doskonałe właściwości retencyjne dla związków niepolarnych. Kolumny/płytki odsalające C18 mogą adsorbować cząsteczki primerów/oligonukleotydów/DNA za pomocą DMT bez retencji soli, co skutkuje produktami primerów/oligonukleotydów/DNA o wysokiej czystości.
Przewodnik po wyborze
BM Life Sciences oferuje kolumny/płytki odsalające C18 w różnych rozmiarach, a właściwą kolumnę odsalania można wybrać na podstawie stężenia primera/oligo. Do przetwarzania wsadowego można wybrać płytkę odsalania 96-dołkową.
| Numer produktu | norma | Obowiązujące specyfikacje oligonukleotydów | Kroki odniesienia |
| Specyfikacja 18W150 | 50 mg/1 ml | 10nmoli - 200nmoli | Krok 5 |
| Specyfikacja 18W3100 | 100 mg/3 ml | 10nmoli - 600nmoli | Krok 1 |
| Specyfikacja 18W3300 | 300 mg/3 ml | 10nmol - 2 .opmol | Krok 2 |
| Specyfikacja 18W61000 | 1g/6ml | 1 umol - 6 umol | Krok 3 |
| SPECYFIKACJA 18W9630 | 30 mg/płytka 96-dołkowa | 5nmoli - 100nmoli | Krok 4 |
| SPECYFIKACJA 18W9650 | 50 mg/płytka 96-dołkowa | 10nmoli - 200nmoli | Krok 4 |
| SPE15C18W9680 | 80 mg/płytka 96-dołkowa (płytka 96-dołkowa 1,5 ml) | 10nmoli - 500nmoli | Krok 5 |
| SPE23C18W9680 | 80 mg/płytka 96-dołkowa (płytka 96-dołkowa 2,3 ml) | 10nmoli - 500nmoli | Krok 5 |
Notatka
Kolumna/płyta czyszcząca C18 może również odsalać surowy produkt i primer/oligo po oczyszczaniu metodą HPLC i PAGE. Szczegóły znajdują się w kroku 5.
Odczynnik
Acetonitryl Stopień Chromatograficzny
0,1 M HERBATY, PH7,0
0,5 mola NaCl
Roztwór płuczący (5% acetonitrylu rozpuszczonego w 0,5 M NaCl)
3% kwasu trifluorooctowego (TFA)
Woda dejonizowana
20% acetonitrylu
Bufor TE: 10 mmol/l Tris-cla, 1 mmol/l EDTA, pH 8,0
Krok 1
Przygotowanie próbki
Dodać 0,5 M NacI do próbki oligonukleotydu do objętości 2 ml.
Aktywacja kolumny odsalania
Aktywacja: Do aktywacji kolumny użyto 1 ml acetonitrylu.
Wyrównywanie: Zrównoważyć kolumnę za pomocą 1 ml 0,1 M roztworu TEAA (PH7,0).
Proces czyszczenia
1. Przepuścić 2 ml roztworu zawierającego oligonukleotydy przez kolumnę odsalającą.
2. Przepłucz kolumnę 2 razy, używając 1 ml roztworu płuczącego, aby usunąć nieudane sekwencje.
3. Przepłucz kolumnę 2 razy 1 ml dejonizowanej wody, aby usunąć sole.
4. Przepłucz kolumnę 2 razy 1 ml 3% kwasu trifluorooctowego, aby usunąć DMT i obserwuj, czy zaadsorbowana warstwa zmieni kolor na pomarańczowo-czerwony;
5. Przepłucz kolumnę odsalającą dwukrotnie 1 ml zdejonizowanej wody, aby usunąć kwas trifluorooctowy i resztki soli.
6. Wyeluuj 1 ml 20% acetonitrylu i złóż.
Krok 2
Przygotowanie próbki
Dodać 0,5 M NacI do próbki oligonukleotydu do objętości 4 ml.
Aktywacja kolumny odsalania
Aktywacja: Do aktywacji kolumny użyto 2 ml acetonitrylu.
Wyrównywanie: Zrównoważyć kolumnę 2 ml za pomocą 0,1 M TEAA (PH 7,0).
Proces czyszczenia
1. Przepuścić 4 ml roztworu zawierającego oligonukleotydy przez kolumnę odsalającą.
2. Przepłucz kolumnę 2 razy, używając 2 ml roztworu płuczącego, aby usunąć nieudane sekwencje.
3. Przepłucz kolumnę 2 razy 2 ml wody dejonizowanej, aby usunąć sole ;)
4. Przepłucz kolumnę 2 razy 2 ml 3% kwasu trifluorooctowego, aby usunąć DMT; warstwa adsorpcyjna powinna zmienić kolor na pomarańczowo-czerwony.
5. Przepłucz kolumnę dwukrotnie wodą demineralizowaną (po 2 ml wody dejonizowanej), aby usunąć kwas trifluorooctowy i resztki soli.
6. Wyeluuj 2 ml 20% acetonitrylu i złóż.
Krok 3
Przygotowanie próbki
Dodać 0,5 M Nac do próbki oligonukleotydu do objętości 10 ml.
Aktywacja kolumny odsalania
Aktywacja: Do aktywacji kolumny użyto 5 ml acetonitrylu.
Wyrównywanie: Kolumnę zrównoważono 10 ml 0,1 m TEAA (PH 7,0).
Proces czyszczenia
1. 10 ml roztworu zawierającego oligonukleotydy przepuszczono przez kolumnę odsalającą.
2. Kolumnę przemyto dwukrotnie 5 ml roztworu płuczącego w celu usunięcia nieudanych sekwencji.
3. Przepłucz kolumnę dwukrotnie 5 ml dejonizowanej wody, aby usunąć sole.
4. Przemyj kolumnę dwukrotnie 5 ml 3% kwasu trifluorooctowego, aby usunąć DMT i zauważ, że warstwa adsorpcyjna zmieniła kolor na pomarańczowo-czerwony.
5. Przepłucz kolumnę dwukrotnie 5 ml zdejonizowanej wody, aby usunąć kwas trifluorooctowy i pozostałości soli.
6. Eluować 5 ml 20% acetonitrylu i zebrać.
Krok 4
Przygotowanie próbki
Dodać 0,5 M Nacl do próbki oligonukleotydu do objętości 0,5 ml.
Aktywacja płytki 96-dołkowej
Aktywacja: Przez każdą studzienkę płytki 96-dołkowej przepuszczono 0,5 ml acetonitrylu.
Równowaga: Zrównoważyć płytkę 96-dołkową przy użyciu 0,5 ml 0,1 M roztworu TEAA (pH 7,0).
Procedura czyszczenia
1. Przepuścić 0,5 ml roztworu zawierającego oligonukleotydy przez płytkę 96-dołkową.
2. Przepłucz płytkę 96-dołkową 2 razy 0,5 ml roztworu płuczącego, aby usunąć nieprawidłowe sekwencje.
3. Płucz płytkę 96-dołkową 2 razy 0,5 ml dejonizowanej wody, aby usunąć sole.
4. Płytkę 96-dołkową przemyj 2 razy 0,5 ml 3% kwasu trifluorooctowego, aby usunąć DMT, i obserwuj, czy warstwa adsorpcyjna zmieni kolor na pomarańczowo-czerwony;
5. Płytkę 96-dołkową przepłukać dwukrotnie 0,5 ml zdejonizowanej wody, aby usunąć kwas trifluorooctowy i pozostałości soli.
6. Wyeluuj 0,5 ml 20% acetonitrylu i zbierz materiał.
Krok 5
Przygotowanie próbki
Dodać 0,5 M Nacl do próbki oligonukleotydu do objętości 1,2/2 ml.
Aktywacja płytki 96-dołkowej
Aktywacja: Do każdego dołka płytki 96-dołkowej dodać po 1–4 ml (0,5 ml) acetonitrylu.
Wyrównywanie: Zrównoważyć płytkę 96-dołkową za pomocą 1–4 ml 0,5 ml 0,1 M roztworu TEAA (PH 7,0).
Proces czyszczenia
1. Przepuścić 0,5–2 ml roztworu zawierającego oligonukleotydy przez płytkę 96-dołkową.
2. Przepłucz płytkę 96-dołkową 2 razy 1/2 ml roztworu do płukania, aby usunąć niefortunne sekwencje ;)
3. Płytkę 96-dołkową przepłukać dwukrotnie 1/2 ml dejonizowanej wody, aby usunąć sole.
4. Dwukrotnie przemyj płytkę 96-dołkową 1/2 ml 3% kwasu trifluorooctowego, aby usunąć DMT, i obserwuj, czy warstwa adsorpcyjna zmieni kolor na pomarańczowo-czerwony;
5. Przepłucz płytkę 96-dołkową 2 razy 1/2 ml dejonizowanej wody, aby usunąć resztki kwasu trifluorooctowego i soli.
6. Wyeluuj 1/2 ml 20% acetonitrylu i zbierz materiał.
Krok 6
Odczynnik
Acetonitryl Stopień Chromatograficzny
0,05 M HERBATA, PH 7,0
2 M HERBATA, PH 7,0
Woda dejonizowana (do odsalania i oczyszczania cząsteczek RNA bez RNazy) 60% acetonitrylu (rozpuszczonego w wodzie zawierającej 0,5% NH4OH)
20% acetonitrylu (do odsalania cząsteczek DNA lub RNA po deprotekcji)
Bufor TE: 10 mmol/l Tris-cla, 1 mmol/l EDTA, pH 8,0
Przygotowanie próbki
Oligo oczyszczone metodą HPLC: Dodać odpowiednią ilość 0,1 M TEAA do oligo oczyszczonych metodą HPLC, tak aby końcowe stężenie acetonitrylu wynosiło ≤5%. Oczyszczone oligo: Rozpuścić fragmenty żelu zawierające oligonukleotydy w 0,05 M TEAA, usunąć fragmenty żelu, rozpuścić oligo w co najmniej 2 ml 0,1 M TEAA.
Oligosacharydy rozpuszczone w NH4OH lub AMA: Odparować do wyschnięcia i rozpuścić w 2 ml 0,1 M TEAA.
Aktywacja pompy odsalania
Aktywacja: Do aktywacji kolumny użyto 1 ml acetonitrylu.
Wyrównywanie: Zrównoważyć kolumnę 1 ml 2 M TEAA (pH 7,0).
Procedura odsalania oligos do oczyszczania metodą HPLC
1. Przepuścić roztwór zawierający oligonukleotydy przez kolumnę odsalającą.
2. Przepłucz kolumnę odsalania dwukrotnie 1 ml zdejonizowanej wody, aby usunąć sole.
3. Eluować przez kolumnę zawierającą 1 ml 60% acetonitrylu i zebrać.
Procedura odsalania oligosów oczyszczonych metodą PAAG
1. Przepuścić roztwór zawierający oligonukleotydy przez kolumnę odsalającą.
2. Przepłucz kolumnę odsalania dwukrotnie 1 ml zdejonizowanej wody, aby usunąć sole.
3. Eluować przez kolumnę zawierającą 1 ml 60% acetonitrylu i zebrać.
Procedura odsalania oligonów DNA po syntezie
1. Przepuścić roztwór zawierający oligonukleotydy przez kolumnę odsalającą; i
2. Przepłucz kolumnę 1 ml 0,1 M TEAA dwukrotnie, aby usunąć nieudane sekwencje.
3. Przepłucz kolumnę odsalania dwukrotnie 1 ml zdejonizowanej wody, aby usunąć sole.
4. Przepuścić przez kolumnę 1 ml 20% acetonitrylu i zmontować.
Procedura odsalania oligonukleotydów RNA po syntezie
1. Przepuścić roztwór zawierający oligonukleotydy przez kolumnę odsalającą.
2. Przepłucz kolumnę 2 ml 0,1 M TEAA.
3. Przepłucz kolumnę 2 ml wody wolnej od rybonukleaz.
4. Przepuścić przez kolumnę 2 ml 20% acetonitrylu (woda wolna od rybonukleaz), eluować i zebrać. Przechowywanie oligonukleotydów
Oligonukleotydy rozpuszczone w 20% acetonitrylu i przechowywane w temperaturze 4°C zapobiegają rozwojowi mikroorganizmów i nadają się do krótkotrwałego przechowywania.
Oligonukleotydy w 20% roztworze acetonitrylu (lub rozpuszczone w buforze alkalicznym, takim jak TE) można przechowywać przez długi czas w temperaturach nawet do -20 °C.
Oligonukleotydy w postaci liofilizowanego proszku można przechowywać przez długi czas.
Ostrzeżenie
Podane ilości odczynników stanowią jedynie zalecenia i należy je optymalizować w każdym konkretnym przypadku.
Podane ilości odczynników stanowią jedynie zalecenia i należy je optymalizować w każdym przypadku indywidualnie.
Kolumna odsalania musi przejść wystarczającą równowagę aktywacji, aby wymyć pozostałości na kolumnie/płytce i poprawić zdolność wiązania kolumny/płytki odsalania. Pobieranie próbek syntetyzowanych oligonukleotydów powinno odbywać się powoli, aby zapobiec przedostaniu się proszku CPG do kolumny/płytki w celu czyszczenia i zanieczyszczenia krzyżowego.
Kolumny/płytki odsalające C18 wykorzystują matrycę krzemionkową, zakres pH wynosi 2-7, przy czym PH > 7,5 łatwo rozpuszcza matrycę krzemionkową, przy PH
Stosując TFA do odsalania DMT, należy zwrócić uwagę na czas, gdyż zbyt długi czas może spowodować usunięcie puryn.
Przywiązać się
Kolumny syntezy fryt CPG B&M Universal Szybka technologia odsalania i oczyszczania
Kolumny do syntezy fryt CPG firmy B&M Universal, technologia szybkiego odsalania i oczyszczania:
Uniwersalne fryty CPG firmy B&M wykonane są z importowanego polietylenu o bardzo dużej masie cząsteczkowej i ultraczystym oraz importowanego proszku CPG, przetwarzanego specjalną technologią, co zapewnia dobry efekt syntezy w kolumnie syntezowej, niską szybkość mutacji i niezawodną jakość produktu.
Po zakończeniu syntezy w syntezatorze serii Dr.Oligo/Mermade i rozpuszczeniu amoniaku, Oligo można eluować bezpośrednio do kolumny syntezowej, a po dozowaniu i odcedzeniu można go użyć do rutynowej reakcji PCR bez dodatkowych etapów oczyszczania, co jest wygodne w obsłudze, obniża koszty i przyspiesza dostawę!
Szczegółowe kroki operacji są następujące:
1. Syntetyczne kolumny/płytki/płytki syntetyczne Synthesis B&M Universal CPG Frits 400ul, 75% mieszaniny acetonitrylu i wody ultraczystej, płukane dwukrotnie w celu usunięcia resztkowych odczynników syntetycznych;
2, B&M Universal CPG Frits syntetyczne kolumny/płytki do amolizy amoniaku, 90°C, 80 PSI, amoliza amoniaku 2-2,5 godz.;
3, 100% acetonitryl 400L kolumna/płytka syntetyczna do płukania, dwukrotnie;
4, 90% mieszanka acetonitrylu i wody ultraczystej 400ul, mycie syntetycznej kolumny/płytki, dwukrotne, pompowanie na sucho;
5. Odpowiednia objętość eluentu do eluowania starterów na syntetycznej kolumnie/płytce; eluentem może być ultraczysta woda, może to być 3% ultraczysta mieszanka trietyloaminy i wody, może to być również około 20% ultraczysta mieszanka acetonitrylu i wody.
6. Roztwór elucyjny można mierzyć, dozować, osuszać, pakować i wysyłać.